4周运动训练小鼠骨骼肌脂滴包被蛋白、比较基因识别58及肌内三酰甘油的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0591

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (3): 354-360.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0591

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4周运动训练小鼠骨骼肌脂滴包被蛋白、比较基因识别58及肌内三酰甘油的表达

廖帅雄1，张国栋2，宋刚1，3

(1西南大学体育学院，重庆市 400715；2国家体育总局体质评价与机能监控重点实验室，重庆市 400715；3西南大学运动康复研究所，重庆市 400715)

收稿日期:2018-08-07 出版日期:2019-01-28 发布日期:2019-01-28
通讯作者: 宋刚，博士，教授，西南大学体育学院，重庆市 400715；西南大学运动康复研究所，重庆市 400715
作者简介:廖帅雄，男，1995年生，重庆市人，汉族，西南大学在读硕士，主要从事运动人体科学研究。

Expression of perilipin, comparative gene identification-58 and triglyceride in mouse skeletal muscle after 4 weeks of endurance training

Liao Shuaixiong1, Zhang Guodong2, Song Gang1,3

(1School of Physical Education, Southwest University,
Chongqing 400715, China; 2Key Laboratory of Physical Evaluation and Function Monitoring of General Administration of Sport of China, Chongqing 400715, China; 3Institute for Sports Rehabilitation, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Received:2018-08-07 Online:2019-01-28 Published:2019-01-28
Contact: Song Gang, PhD, Professor, School of Physical Education, Southwest University, Chongqing 400715, China; Institute for Sports Rehabilitation, Southwest University, Chongqing 400715, China
About author:Liao Shuaixiong, Master candidate, School of Physical Education, Southwest University, Chongqing 400715, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
比较基因识别58 (CGI-58)：比较基因识别58也被称作α/β 水解酶结构域蛋白5，是一个含α/β水解结构域的酶，属于脂肪酶家族，其本身并不具有脂肪酶的活性，但可通过激活脂肪三酰甘油脂肪酶使ATGL水解脂肪的活性大幅度提高，并且它也是参与角质形成细胞分化过程的重要分子。此外，比较基因识别58还具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性，可将溶血磷脂酸酰化成磷脂酸。
肌内三酰甘油：肌内三酰甘油在人体的储备有限，只占全身脂肪含量的1%-2%，在肌纤维中以脂肪小滴的形式存在，由于肌细胞浆中的脂滴位置大多靠近线粒体，所以肌内三酰甘油可被机体迅速水解氧化为肌肉活动提供能量，因而它又是一种重要的能量来源。

摘要
背景：骨骼肌中也存在比较基因识别58和脂滴包被蛋白的表达，国内外的研究大都集中在训练骨骼肌激素敏感性脂肪酶调节脂肪分解的作用上，对运动时骨骼肌肌内三酰甘油、脂滴包被蛋白家族与比较基因识别58变化的研究较少。
目的：观察4周运动训练C57BL/6J小鼠骨骼肌脂滴包被蛋白家族和比较基因识别58的变化，探讨其与肌内三酰甘油变化的关系。
方法：80只6周龄雄性健康SPF级C57BL/6J小鼠，按运动训练前，运动1，2，3，4周5个时相，随机分为对照组和耐力训练组各5 组。耐力训练组第1周为适应性训练；正式训练4周，每周6 d，训练时间在早上 8：00-12：00，以16 m/min，5%度坡度进行40 min跑台运动；安静组自由饮食。检测小鼠体质量和血液指标；小鼠腓肠肌和比目鱼肌肌内三酰甘油含量、脂滴包被蛋白家族和比较基因识别58基因及蛋白的表达。
结果与结论：①耐力训练对小鼠体质量、血糖和游离脂肪酸的变化没有影响，降低血总三酰甘油、血总胆固醇和胰岛素水平(P < 0.05)，增加高密度脂蛋白胆固醇水平(P < 0.05)；②比目鱼肌中的肌内三酰甘油高于腓肠肌；耐力训练时，骨骼肌肌内三酰甘油先降后升(P < 0.05)；③耐力运动过程中，骨骼肌(比目鱼肌和腓肠肌)脂滴包被蛋白家族(除PLIN2)、比较基因识别58基因和蛋白显著增加(P < 0.05)；④耐力训练早期，脂滴包被蛋白家族(除PLIN2)、比较基因识别58基因和蛋白的表达变化参与了对肌内三酰甘油水解的调节；随后其效果减弱，揭示肌内三酰甘油合成途径的影响大于分解途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-7025-4776(廖帅雄)

关键词: 运动训练, 骨骼肌, 肌内三酰甘油, 脂滴包被蛋白家族, PLINs, 比较基因识别58, CGI-58, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Comparative gene identification-58 and perilipins (2-5) are expressed in skeletal muscle. There are many studies addressing hormone sensitive lipase regulating steatolysis in skeletal muscle, but changes of triglyceride, perilipin family proteins and comparative gene identification-58 in skeletal muscle during exercise are little reported.
OBJECTIVE: To investigate the effects of 4-week endurance training on the expression of perilipin family proteins and comparative gene identification-58 in C57BL/6J mice, and to explore their correlation with triglyceride level.
METHODS: Eighty 6-week-old male healthy SPF C57BL/6J mice were randomly divided into control group and endurance training group according to the time-points pre-exercise, 1, 2, 3 and 4 weeks post-exercise. The first week of endurance exercise was adaptive training, and the formal training lasted for 4 weeks, 6 days weekly, the training time in the morning 8: 00-12: 00, with 16 m/minute, 5% degree slope for 40 minutes of treadmill exercise. Mice in the control group were allowed free access to food. The body mass and blood indexes were tested. The triglyceride level, expression of perilipin family proteins and comparative gene identification-58 in mouse gastrocnemius and soleus were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Endurance training showed no effect on mouse body mass, blood glucose and free fatty acids, and significantly reduced blood total triglyceride, total cholesterol and insulin levels (P < 0.05), and increased the level of high density lipoprotein cholesterol (P < 0.05). The intramuscular triglyceride of the soleus muscle was higher than that of the gastrocnemius muscle. During the period of endurance training, intramuscular triglycerides firstly reduced and then rose (P < 0.05). In the working muscles (soleus and gastrocnemius) perilipin family proteins (except perlipin 2), comparative gene identification-58 mRNA and protein were significantly increased (P < 0.05). In summary, in the early stage of endurance training, changes in perilipin family proteins (except PLIN2), comparative gene identification-58 mRNA and protein expression participate in the regulation of hydrolysis, and their participation is weakened thereafter, indicating intramuscular triglyceride synthesis on fat is stronger than its hydrolysis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Muscle, Skeletal, Triglycerides, Resistance Training, Tissue Engineering

中图分类号:

R446

廖帅雄, 张国栋, 宋刚. 4周运动训练小鼠骨骼肌脂滴包被蛋白、比较基因识别58及肌内三酰甘油的表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(3): 354-360.

Liao Shuaixiong, Zhang Guodong, Song Gang, . Expression of perilipin, comparative gene identification-58 and triglyceride in mouse skeletal muscle after 4 weeks of endurance training[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(3): 354-360.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析实验选用小鼠80只，分为2组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 耐力运动训练小鼠体质量和血液指标从表2可知，体质量随时间的持续而增长，与训练前相比，训练组和对照组小鼠的体质量都显著地增长(P < 0.05)，但训练组与对照组在训练期的同一时间，体质量差异并无显著性意义 (P > 0.05)；在训练4周末，训练组小鼠体质量显著低于对照组(P < 0.05)。耐力训练期间的血糖、游离脂肪酸(FFA)水平出现无规律的变化，差异无显著性意义(P > 0.05)。血总三酰甘油在训练组随耐力训练时间出现显著性的降低 (P < 0.05)，血总三酰甘油和血总胆固醇在训练组耐力训练的第3，4周显著低于对照组(P < 0.05)。高密度脂蛋白胆固醇在训练第2，3，4周，运动组高于训练前的水平，并与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，胰岛素训练组出现显著降低的变化趋势，运动4周与训练前相比，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 耐力运动训练小鼠腓肠肌和比目鱼肌肌内三酰甘油水平从表3可知，肌内三酰甘油在比目鱼肌比腓肠肌中含量要高10倍左右。无论是腓肠肌还是比目鱼肌肌内三酰甘油，随着耐力训练的持续，小鼠腓肠肌和比目鱼肌两者的肌内三酰甘油出现先降再升的变化趋势(P < 0.05)，在训练第2周达到低值(P < 0.05)，并在训练第4周达到峰值，与运动前和对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.4 耐力运动训练小鼠比目鱼肌PLIN家族和CGI-58基因表达从表4可知，耐力训练时，比目鱼肌PLIN3，PLIN5和CGI-58的基因表达出现显著增长的趋势；与训练前相比，峰值出现在训练第4周(P < 0.05)，PLIN3和PLIN5基因表达在训练第2，3和4周，出现显著性的上升(P < 0.05)；CGI-58在训练第3，4周，与训练前比，出现显著性的上升(P < 0.05)。训练组与对照组相比，PLIN3和PLIN5基因表达在训练第2，3，4周显著高于对照组；训练组CGI-58基因表达在训练第3，4周显著高于对照组 (P < 0.05)。耐力训练对PLIN2和PLIN4的影响不具有规律性变化(P > 0.05)。

2.5 耐力运动训练小鼠比目鱼肌PLIN家族和CGI-58蛋白表达如表5和图1所示，耐力训练时，比目鱼肌PLIN3，PLIN4，PLIN5和CGI-58蛋白表达显著增长，在训练4周达到峰值(P < 0.05)。训练组PLIN3、PLIN4和CGI-58蛋白表达在训练第4周，出现显著性的上升，与训练前和对照组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)。PLIN5在训练第2，3，4周与训练前和对照组相比，显著上升(P < 0.05)。

2.6 耐力训练小鼠腓肠肌PLIN家族和CGI-58基因表达如表6所示，从训练组的数据可知，耐力训练引发腓肠肌PLIN3，PLIN4，PLIN5和CGI-58的基因表达出现显著增长的趋势；与训练前相比，峰值出现在训练第4周(P < 0.05)，PLIN3和CGI-58基因表达在训练第2，3，4周出现显著性的上升(P < 0.05)；PLIN5在训练第1，2，3，4周，与训练前比出现显著性的上升(P < 0.05)。训练组与对照组相比，PLIN3和CGI-58基因表达在训练第2，3，4周显著高于对照组；训练组PLIN5基因表达在训练第1，2，3，4周显著高于对照组(P < 0.05)。训练组PLIN4在第3，4周与对照组相比，显著增加(P < 0.05)。耐力训练对PLIN2的影响不具有规律性变化(P > 0.05)。

2.7 耐力训练小鼠腓肠肌PLIN家族和CGI-58蛋白表达如图2和表7所示，耐力训练时腓肠肌PLIN3，PLIN5和CGI-58的蛋白表达逐渐提高，在训练第4周达到峰值(P < 0.05)。耐力训练腓肠肌PLIN3在训练前、训练第2，3，4周与对照组相比，蛋白表达逐渐提高，差异有显著性意义(P < 0.05)。PLIN2和PLIN4蛋白表达在训练1周显著高于对照组(P < 0.05)。CGI-58蛋白表达第3，4周与训练前和对照组相比，蛋白表达逐渐提高(P < 0.05)。

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引言

三酰甘油氧化代谢、糖代谢(含糖原酵解系统)和ATP-CP系统为运动提供能量。肌内三酰甘油只占全身脂肪含量的1%-2%，因为它靠近线粒体，这可能与肌内三酰甘油在肌纤维中以脂肪小滴的形式存在，一般分布在线粒体周围，可以迅速水解氧化，为肌肉活动供能有关^[1]。运动时骨骼肌肌内三酰甘油水解成脂肪酸进入线粒体氧化供能^[2]。同时，肌内三酰甘油含量与胰岛素抵抗、2型糖尿病呈负相关；肌内三酰甘油含量上升，会抑制胰岛素信号传导途径，引起肌肉胰岛素抵抗。而骨骼肌对肌内三酰甘油氧化的提高，有助于减少肌内三酰甘油含量，能起到改善肌肉胰岛素抵抗的作用^[3-4]。肌内三酰甘油含量动态平衡对新陈代谢稳态的维持至关重要，骨骼肌脂肪水解和脂肪氧化是一个多蛋白和酶参与的复杂过程，参与运动性骨骼肌适应的调节^[5]。围绕肌内三酰甘油含量的变化及调控信号蛋白的研究，已逐渐引起大家的关注。

肌内三酰甘油的水解主要受脂滴包被蛋白(perilipin，PLINs)家族和比较基因识别58(comparative gene identification-58，CGI-58)所调节。在骨骼肌中，肌内三酰甘油包裹在由一个磷脂单分子膜结构形成的脂滴之中， PLINs家族参与了肌内三酰甘油生成和水解代谢的调节。目前，对骨骼肌PLIN家族蛋白的研究比较有限，在其他组织(非骨骼肌组织)和细胞培养的实验证据表明，PLIN蛋白是脂肪代谢的关键调节蛋白，它们可能直接参与脂肪酸在细胞和组织中的贮存和动用^[6-7]。PLIN家族包括5个成员，PLIN1、PLIN2、PLIN3、PLIN4和PLIN5，每个PLIN家族成员都有独特的组织分布^[8]。CGI-58也被叫作α/β水解酶结构域蛋白5(ABHD5)，是一个含α/β水解结构域的酶，它本身并不具有脂肪酶的活性，通过激活脂肪三酰甘油脂肪酶(ATGL)，使其水解脂肪的活性大幅度提高，在脂类代谢过程中发挥着重要作用^[9]。由于CGI-58在脂类代谢中的重要功能是最近几年才被发现，并且在人体和小鼠的骨骼肌中都有表达^[10-11]，所以CGI-58调控脂肪代谢的作用已经成了生命科学领域的一个新的研究热点。CGI-58作为一种新发现的脂肪细胞分解代谢激活剂，参与并启动脂质的代谢，使研究者对脂质的分解代谢有了更进一步的认识。

在运动训练过程中，肌内三酰甘油动员由外部的激素刺激(如增加肾上腺素)通过信号分子实现。目前已知PLIN家族和CGI-58是参与调节肌内三酰甘油水解功能的蛋白，骨骼肌中也存在PLIN(2-5)蛋白和CGI-58的表达。以前的研究都集中在训练骨骼肌激素敏感性脂肪酶调节脂肪分解的作用上，而对运动训练过程中骨骼肌肌内三酰甘油水解的具体调节机制却知之甚少。有研究表明脂肪细胞中的PLIN1可通过CGI-58(脂肪三酰甘油脂肪酶的激活剂)相互作用来调节脂肪水解，在脂肪水解过程中，PLIN1磷酸化，结合CGI-58激活脂肪三酰甘油脂肪酶并启动三酰甘油水解。然而PLIN1在骨骼肌中并不表达，但骨骼肌中的肌内三酰甘油动员却很活跃，尤其是在中等强度的运动过程中^[12]，所以推断PLIN家族[PLIN(2-5)]的其他成员在骨骼肌中也很可能起到了类似作用。

该研究采用小鼠跑台耐力训练方式，研究PLIN家族和CGI-58的变化，同时探讨它们的变化与骨骼肌肌内三酰甘油水平的关系。通过研究PLIN家族和CGI-58的调节实现脂肪含量的有效调控，不仅对肥胖及其并发症发病机制有重要的临床意义，而且还为脂肪堆积所引起的一系列疾病提供了一个新的药物治疗靶点，为预防肥胖和脂代谢紊乱性疾病提供了重要的依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点动物运动及指标测定于2015年9月在南宁市广西大学动物科学学院完成，结果分析于重庆市西南大学体育学院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 6周龄雄性健康SPF级C57BL/6J小鼠80只购于北京华阜康生物科技股份有限公司，体质量为203-229 g。动物房饲养环境：室温20-25 ℃，相对湿度50%-70%，每日光照时间为12 h。国家标准啮齿动物饲料，自由饮食，常规分笼饲养，每笼8只。将80只C57BL/6 J小鼠随机均分为运动组(n=40)和对照组(n=40)。

1.3.2 实验用试剂及仪器肌内三酰甘油测定酶联免疫试剂盒(北京普利莱基因公司)；酶标仪(瑞士Tecan公司，infinite M200 PRO)；游离脂肪酸测定酶联免疫试剂盒(货号：mselisa0 126，UCL，美国)，胰岛素测定酶联免疫试剂盒 (货号：20150911，福瑞生物工程公司，北京)，血糖仪(德国Roche诊断公司，型号：ACCU-CHEK Active)；颐兰贝全自动生化分析仪ES-200(南京)。

1.3.3 抗体 PLIN2 (52 kDa，鼠单克隆抗体货号：610102，Progen Biotechnik，Heidelberg公司，德国)；PLIN3(47 kDa货号 No.3883，ProSci Inc公司，美国)；PLIN4(140 kDa，Progen公司，德国)；PLIN5 (52 kDa，豚鼠多克隆抗体，货号：Nos.GP34 and GP31，Progen Biotechnik公司)；CGI-58 (42 kDa，兔多克隆抗体货号：NB110-41576，Novus Biologicals公司，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验方案采用ZH-PT型动物实验跑台进行耐力训练。适应性训练为运动5 min，目的是使小鼠习惯动物跑台，依据Bae等^[13]的报道制定训练方案，正式训练为以 16 m/min (5%度坡度)进行40 min跑台运动。训练为期5周，第1周为适应性训练；正式训练4周，每周训练6 d，训练时间在早上8：00-12：00。对照组正常饮食，自由分笼饲养。C57BL/6J小鼠测定体质量按编号逐个进行，先将电子秤固定好，将小鼠用开口塑料瓶装入进行体质量测定。

1.4.2 实验取材训练结束后次日8：00，在禁食状态下，C57BL/6J小鼠按分组进行断头处死，静置收集血液 10 min，按实验要求分制血浆和血清，分别取左下肢腓肠肌和比目鱼组织，以上取材操作均在冰上完成。各取约1 g用生理盐水洗干净后，用锡纸包好迅速放入液氮中速冻，转置-70 ℃超低温冰箱冻存，待测。

1.4.3 组织和血液生化指标小鼠肌组织肌内三酰甘油采用ELISA法检测，测试过程严格按照试剂盒说明进行，在450 nm波长下测定吸光度(A值)，通过标准曲线计算样品中小鼠肌组织肌内三酰甘油浓度；游离脂肪酸使用酶联免疫试剂盒测定；胰岛素使用酶联免疫试剂盒测定；血糖采用血糖仪和血糖试纸测定；血总三酰甘油(TG)、血总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)使用全自动生化分析仪ES-200测定。

1.4.4 引物设计和PCR测定根据NCBI数据库中已知的小鼠CGI-58、PLIN2、PLIN3、PLIN4、PLIN5基因和β-actin基因的序列，利用Oligo6.0软件分别设计荧光定量引物，引物序列，见表1。

引物由上海生工生物公司合成，相关蛋白的基因表达使用定量实时聚合酶链反应分析。反应体系为20 μL：1 μL RT-PCR产物，0.6 μL Primer F/R(10 μmol/L)，10 μL 2×FastStart Universal SYBR Green Master(罗氏公司)和8.4 μL RNase FreeH₂O；反应条件为：95 ℃ 10 min； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，持续循环40次。每个样品进行4次重复，采用2^-^??Ct计算目的基因的相对表达量。

表注：CGI-58：比较基因识别58；PLIN：脂滴包被蛋白。

表1 qRT-PCR引物序列及相关条件

Table 1 Primer sequences for qRT-PCR and related conditions

基因名称	引物序列(5'-3')	产物(bp)	退火温度(℃)
CGI-58	F：GAG TTC CAC AAA CAC CCA C	148	61.5
	R：GCT TTT TCC AGT CCT TCT
PLIN2	F：TAG ACA GGA TGG AGG AAA GAC	232	60.5
	R：AAA ACT GTA TTG ATG CTG CC
PLIN3	F：GTG GGA CAG ATG GTG ATT AG	221	59.1
	R：GAG TGT TCA TAG GCG TGA TT
PLIN4	F：ATG GTG GAG GCT GTT GGT AG	115	57
	R：CCT GCA GGC TGG TTA CTA GG
PLIN5	F：GAC ATC AGC CAA GGA TAC AG	258	59.6
	R：AGA CGC ACA AAG TAG CCC
β-actin	F：GCT ACA GCT TCA CCA CCA CA	203	55
	R：AAG GAA GGC TGG AAA AGA GC

1.4.5 Western Blotting所采集的肌肉组织(腓肠肌和比目鱼)加入RIPA裂解液裂解组织，并添加PMSF蛋白酶抑制剂，终质量浓度为100 mg/L，以防止蛋白降解。在冰上裂解30 min后，置于12 000 r/min离心10 min，然后取离心液上清，把上清按体积比加入4×的缓冲液，再把混合液用沸水

煮沸变性10 min；再将变性后的蛋白进行SDS-PAGE(10%分离胶)电泳跑胶分离。电泳后使用伯乐半干转印系统，将蛋白转移到硝酸纤维素膜(Millipore)上；再放置于5%脱脂牛奶室温封闭45 min，然后用TBST冲洗3次，每次10 min，抗体用一抗稀释液(1∶500)稀释后，4 ℃冰箱孵育过夜；第2天，用TBST彻底洗膜3次，每次10 min，山羊抗兔Ig-HRP二抗室温孵育1 h，然后TBST彻底洗膜3次，硝酸纤维素膜加ECL化学发光液，再用伯乐成像系统进行成像，用Imagelab软件进行分析试验结果。

1.5 主要观察指标 ①小鼠体质量和血液指标；②小鼠腓肠肌和比目鱼肌肌内三酰甘油水平；③小鼠腓肠肌、比目鱼肌PLIN家族和CGI-58基因及蛋白的表达。

1.6 统计学分析用x(_)±s表示数据，经正态性检验后，统计学方法采用双因素方差分析(Two-Way ANOVA)，事后检验使用Duncan法，用SPSS 18.0软件进行统计处理，图由Sigmaplot 12软件生成。显著性水平为0.05，非常显著性水平为0.01。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

3.1 耐力训练小鼠体质量、血液指标和肌内三酰甘油的变化该研究中小鼠体质量随耐力训练时间的持续而增长，耐力训练对其影响不大。同时，还发现血糖和游离脂肪酸也没有出现显著性的变化。这可能是因为以16 m/min(5%度坡度)进行40 min跑台运动训练，持续4周的正式耐力训练，并不足以改变小鼠的生长规律，因此体质量并没有随耐力训练出现显著性改变；也许持续时间超过4周会引起耐力组与对照组体质量出现显著性差异。血糖和游离脂肪酸的变化不显著也可能是因为4周耐力训练达不到训练负荷量。作者发现，肌内三酰甘油在比目鱼肌中的水平比腓肠肌高10倍左右，这与快慢肌运动性骨骼肌适应相一致^[14]。耐力训练过程中，小鼠腓肠肌和比目鱼肌的肌内三酰甘油较训练前显著增加，并在训练第4周达到峰值，与运动前和对照组相比差异有显著性意义。这提示，肌内三酰甘油对4周的耐力训练刺激较为敏感，出现了显著的增加，这可能与耐力训练促进骨骼肌对血液中游离脂肪酸摄入有关。

3.2 比目鱼肌和腓肠肌PLIN家族、CGI-58基因与蛋白表达变化脂肪分解包括三酰甘油顺序分解产生游离脂肪酸，主要用于能源的产生，是一个高度保守的功能。以往的脂肪水解知识来自于脂肪组织的代谢研究。脂肪水解是由一个复杂酶系所调节，涉及磷酸化贩运和包括几个关键蛋白相互作用，最关键的为PLIN1、脂肪三酰甘油脂肪酶和CGI-58三个酶类^[15-16]。PLIN1是调节脂肪水解的一个关键因子，通过蛋白-蛋白的相互作用于脂滴表面。在β-肾上腺素引发的脂肪水解中、蛋白激酶A(PKA)磷酸化导致PLIN1和CGI-58解离^[17]。PLIN1通过激活CGI-58能够结合并激活脂肪三酰甘油脂肪酶，将有助于脂滴中存储的三酰甘油转变为脂肪酸^[11^，^18]。骨骼肌有4个蛋白的序列与PLIN1相近，被命名为PLIN2-5^[19-20]。骨骼肌收缩所引发的脂肪水解，是由于脂肪三酰甘油脂肪酶和CGI-58与PLIN2-5相互作用所激活^[11]。

虽然PLIN1不在骨骼肌中表达，但有证据表明在骨骼肌中肌内三酰甘油水解需要PLIN2-5在脂滴表面与蛋白质相互作用，其方式和在脂肪组织中观察到的调节方式相似^[21]。尽管骨骼肌与脂肪组织存在明显的差异，在有氧训练过程中骨骼肌会增加老年人肌内三酰甘油代谢率，PLIN2和3均参与了这一过程^[22]。其原因可能是，脂肪组织的脂肪水解目的在于释放和提供脂肪酸给其他组织使用，而骨骼肌脂肪分解的目的是提供脂肪酸直接进入线粒体氧化，后者利用的效率更高。训练促使骨骼肌激酶活化，并调节脂肪分解的速率。在骨骼肌中，PLIN2通过与脂滴表面相互作用，反映脂肪含量和脂滴的生长；PLIN3和PLIN5在骨骼肌中的作用似乎更复杂，因为它们不仅存在于脂滴中，还存在于线粒体中^[23-24]。PLIN5可能是骨骼肌脂肪代谢的主要调节因子，并且参与脂肪酸从脂滴到线粒体的转运^[25-26]。PLIN5可能还具有在心脏和脂肪分解过程中调节脂肪酸在骨骼肌线粒体中释放的功能，若PLIN5缺失会导致脂肪酸氧化增加，进而使心肌和骨骼肌不能形成脂滴^[27-28]。

该研究发现，4周运动训练骨骼肌(比目鱼肌和腓肠肌)都出现PLIN3和PLIN5基因和蛋白表达随耐力训练时间的变化，而出现上升的变化趋势，这种趋势具有显著性意义。2013年，Macpherson等^[29]利用大鼠比目鱼肌在25 ℃下，进行了4组30 min的体外实验，4种干预方式分别为：①静置；②间歇性强直刺激(60 Hz/150 ms；20 min)；③5 nmol/L肾上腺素；④间歇性强直刺激加5 nmol/L肾上腺素。结果发现，利用肾上腺素和收缩刺激观察到骨骼肌PLIN3和PLIN5在丝氨酸位点上呈现磷酸化，两者的基因和蛋白表达也出现上升，这与作者的实验结果相一致。同时，作者还发现骨骼肌PLIN4与CGI-58基因和蛋白表达也存在随耐力训练上升的变化趋势，这在以往研究中并未发现。耐力训练过程中，骨骼肌PLIN2的基因和蛋白表达变化不显著，这与Macpherson等^[29]的报道相一致，他们的研究发现，PLIN2在安静时和水解时都没有出现磷酸化。这可能是因为骨骼肌中的PLIN2对肾上腺素，间歇性强直刺激和耐力训练等刺激不反应，表明PLIN2没有通过与CGI-58和ATGL相互作用，参与工作骨骼肌肌内三酰甘油水解的调节，而可能是PLIN家族的其他蛋白参与了肌内三酰甘油水解过程。

众所周知，骨骼肌中肌内三酰甘油的含量变化是三酰甘油合成与分解的一个动态过程。该研究结果表明，4周运动训练过程中骨骼肌肌内三酰甘油含量先降后升而骨骼肌中PLIN3、PLIN5和CGI-58的表达持续增加；4周运动训练骨骼肌肌内三酰甘油含量先降后升可能是因为在训练第2周时，即PLIN家族(除PLIN2)、CGI-58基因和蛋白表达上升，通过互相作用激活脂肪水解相关酶系反应，引发了肌内三酰甘油下降，说明此时肌内三酰甘油合成作用要小于分解作用，总体表现为肌内三酰甘油水平的下降；但随后，肌内三酰甘油含量却呈现显著上升的变化；随着耐力训练时间的延长，骨骼肌内肌内三酰甘油的合成大于分解，PLIN家族(除PLIN2)、CGI-58基因及蛋白表达上升，肌内三酰甘油含量总体体现为上升。因为该研究没有测定肌内三酰甘油合成代谢途径的有关指标，无法确认PLIN家族(除PLIN2)、CGI-58是否通过基因和蛋白的表达参与了对肌内三酰甘油水解的调节；但可以肯定的是，因为腓肠肌和比目鱼肌的指标变化具有同步性，所以这种调节不具有快慢肌的差异。

PLIN家族(除PLIN2)、CGI-58对肌内三酰甘油的水解作用在耐力训练的早期效果明显，时间越长，其作用越小，这可能是由于肌内三酰甘油的合成作用大于水解作用所致。血总三酰甘油的变化呈现下降的趋势，肌肉可能通过从血中摄入三酰甘油来增加肌肉中肌内三酰甘油的贮备，但胰岛素(合成类激素)水平呈现下降的变化趋势，这表明胰岛素在耐力训练中并没有参与肌内三酰甘油含量增加的调节。该研究下一步拟对耐力训练骨骼肌肌内三酰甘油合成体系展开研究，更好地探究肌内三酰甘油合成与分解调节的动态规律。

结论：该研究发现4周耐力训练小鼠骨骼肌(比目鱼肌和腓肠肌)PLIN家族(除PLIN2)、CGI-58基因和蛋白显著增加；随耐力训练的持续，肌内三酰甘油含量先降再增表明运动前期分解途径的作用大于合成途径，而后期合成大于分解，总体表现为肌内三酰甘油含量增加。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

4周运动训练小鼠骨骼肌脂滴包被蛋白、比较基因识别58及肌内三酰甘油的表达

Expression of perilipin, comparative gene identification-58 and triglyceride in mouse skeletal muscle after 4 weeks of endurance training

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